Gensplejsning af en bakterie
Gensplejsning af bakterier trin for trin
1. Det menneskelige gen for insulin isoleres. Enderne klippes af med et restriktionsenzym, der er en DNA-saks. Det her hedder EcoR1 og klipper ved baserne AATT. Vi har nu skåret det overflødige DNA væk og har kun insulin-DNA.
2. Nu isoleres et plasmid fra bakterien. Læg mærke til at det indeholder resistensgener ampicillin og tetracyklin, dvs. bakterien er resistent overfor de to antibiotika. Det skal vi bruge senere i screeningsprocessen, hvor vi skal finde ud af hvilken bakterie der er gensplejset.
Også plasmidet klippes op med restriktionsenzymet EcoR1.
3. Enderne der er klippet på både plasmidet og insulin-DNA’et passer sammen fordi AATT er komplementært til TTAA. Vi kalder dem ”sticky ends” og de kan sættes sammen i tre forskellige kombinationer. Der tilsættes ligase som er en DNA-lim der hjælper enderne med at sætte sig sammen.
4. De tre kombinationsmuligheder er:
a. Insulin som binder sig til sin egen hale. Det plasmid er ubrugeligt fordi et gen alene aldrig kan udtrykkes. Der er behov for nogle yderligere DNA-sekvenser for at igangsætte proteinsyntesen.
b. Det gensplejsede plasmid. Vores insulin-gen har sat sig ind i det opklippede plasmid. Det er dét plasmid vi er interesseret i, fordi det kan producere insulin hvis det er indsat i en bakterie.
c. Det oprindelige plasmid som har lukket sig samme sted som det blev klippet op. Det indeholder ikke insulingenet.
5. Plasmiderne og bakterier blandes sammen og ved at tilsætte en svag strøm eller saltvand optager bakterierne plasmiderne.
6. Bakterierne opformeres, men vi ved endnu ikke hvilket plasmid der er i hvilken bakterie. Vi begynder med at placere bakterierne på en agarplade, og hver bakterie deler sig og danner en koloni. På figuren er der 12 kolonier, som hver især består af ens bakterier.
7. Antibiotikummet tetracyklin tilsættes og de bakterier som ikke er resistente dør. Det er kun bakterier med den lille ring insulin gen. De to andre har genet fra bakteriens plasmid. Nu har vi de gensplejsede gen og det oprindelige plasmid tilbage.
8. I det næste trin slår vi den gensplejsede bakterie ihjel, så derfor laver vi først en kopi. Det gøres let ved at duppe en svamp på agarpladen og trykke den ned på en ny ren agarplade, og når blot få bakterier bliver overført, så dannes der nye kolonier.
9. Det andet antibiotika – ampicillin tilsættes og det dræber de gensplejsede bakterier. Og hvorfor, jo hvis du ser i figur 2, så klippes det grønne ampicillin gen over, så det ikke længere fungerer, og bakterien er ikke længere resistent. Hvis plasmidet lukker sig igen uden at der indsættes et insulin gen, så vil det naturligvis blive resistent igen.
10. Nu ved vi hvilke tre kolonier af resistente bakterier der er gensplejsede. De bliver opformeret i store tanke på Novo Nordisk hvor vi kan udvinde insulin fra dem.